Ena viala, dve tarči: prenosna diagnostika tuberkuloze na osnovi CRISPR s 100-odstotno občutljivostjo

V reviji Science Advances je bil objavljen članek o prenosnem testu za tuberkulozo, ki ga je mogoče opraviti neposredno iz sputuma brez kompleksne opreme. Izotermna amplifikacija DNK in odčitavanje CRISPR sta združena v eni sami epruveti; hkrati se testirata dva konzervativna vstavka M. tuberculosis (IS6110 in IS1081) ter človeški gen kot notranji kontrolni vzorec. V majhnem "slepem" testu na kliničnih vzorcih je test pokazal 100-odstotno občutljivost (6/6) in 100-odstotno specifičnost (7/7) v primerjavi s kulturo; meja zaznavnosti je ~69–81 CFU/ml v simuliranem sputumu. Rezultat je viden na papirnatem testnem traku, reagenti pa so liofilizirani (shranjevanje brez "hladne verige").

Ozadje

Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije bo tuberkuloza leta 2023 ubila približno 1,25 milijona ljudi; tuberkuloza je s približno 10,8 milijona primerov ponovno postala vodilni vzrok smrti med nalezljivimi boleznimi. Zaradi tega je dostopna in hitra diagnostika ključnega pomena, zlasti v okoljih z omejenimi viri.

• Trenutni testi so kompromis med natančnostjo, hitrostjo in ceno. »Zlati standard« kultur je zelo natančen, vendar počasen; mikroskopija je hitra, vendar neobčutljiva; PCR platforme, kot je Xpert MTB/RIF Ultra, so bistveno bolj občutljive (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), vendar zahtevajo drago opremo in kartuše, kar omejuje pokritost.
• Zakaj izotermno in CRISPR. Izotermna RPA amplifikacija deluje pri 37–42 °C in ne zahteva termociklerjev – priročno »na terenu«. Odčitavanje CRISPR (Cas12/13) doda specifičnost za vrsto in omogoča vizualni lateralni tok (»strip«) brez zapletene optike. Skratka, to je pot do prenosnih in poceni PVR testov.
• Zakaj dve tarči MBT hkrati (IS6110 + IS1081). IS6110 je večkopijski vložek kompleksa M. tuberculosis, vendar imajo nekatere linije malo kopij in testi samo za IS6110 lahko »zgrešijo«. Dodajanje drugega vstavka IS1081 zmanjša tveganje za lažno negativne rezultate.
• Zakaj notranji človeški nadzor. Vzorci izdihanega zraka lahko vsebujejo inhibitorje in "slabe" vzorce. Endogeni človeški nadzor (npr. RNaza P/genomska DNK) potrjuje, da je material ustrezen in da reakcija ni potlačena – sicer rezultata ni mogoče šteti za negativnega.
• Enoposteljna oblika je sama po sebi pomembna. Zmanjšuje število korakov, zmanjšuje tveganje kontaminacije in olajša delo zunaj laboratorija. Takšni pristopi za tuberkulozo so se že pokazali kot izvedljivi; novo delo razširja idejo na dvojno tarčno obliko z notranjimi kontrolami, poleg tega pa prikazuje liofilizacijo reagentov in čitalnik trakov.
• Kakšna je vrednost tega članka? Avtorji so pokazali detekcijo neposredno iz sputuma po najbolj poenostavljeni pripravi vzorca, mejo detekcije pri ~70–80 CFU/ml v simuliranem sputumu in 100-odstotno občutljivost/specifičnost na majhnem slepem naboru kliničnih vzorcev – dober »tehnološki demo« za nadaljnje multicentrične validacije.

Kako to deluje

• Znanstveniki so združili RPA (hitro izotermno amplifikacijo genskega materiala pri 37 °C) z "rezalnima" encimoma Cas13a/Cas12a. Po izbiri vodilnih RNA so sistem konfigurirali tako, da hkrati cilja na dve tarči MBT in vzporedno s človeško DNK (pri čemer so preverili, ali je v vzorcu sploh material in ali se reakcija ni "zastavila").
• Vsa kemija gre v eno epruveto; po inkubaciji se rezultat odčita bodisi s fluorimetrom bodisi na lateralnem pretočnem traku – v bistvu kot pri hitrem testu.
• Obdelava sputuma je bila poenostavljena na segrevanje in kratko centrifugiranje – brez ekstraktorjev nukleinskih kislin. Za najbolj omejene pogoje avtorji celo razpravljajo o ročnih alternativah centrifugi.

Kaj so pokazali testi

• Meja detekcije: 69,0 CFU/ml (sev H37Rv) in 80,5 CFU/ml (BCG) v "koničnem" sputumu. Navzkrižne reaktivnosti z drugimi bakterijami/glivami niso zaznali.
• Klinično okolje (slepi vzorci): na 13 vzorcih iz resnične prakse - 100-odstotna občutljivost (6/6) in 100-odstotna specifičnost (7/7) glede na dovajanje. Za primerjavo, GeneXpert Ultra je na istem kompletu pokazal 100 % oziroma 86 %.
• Tehnične nianse: od obeh možnosti odčitavanja se je Cas13a obnesel bolje (za format "one-pot" je občutljivejši kot Cas12a). Poleg tega vzporedno testiranje dveh tarč Mtb zmanjša tveganje za lažne rezultate.

Zakaj je to potrebno?

Današnji testi so kompromis med natančnostjo, hitrostjo in razpoložljivostjo: kultura je zelo natančna, a počasna; brisi so hitri, a nenatančni; sistemi PCR, kot je GeneXpert, so natančni in hitri, vendar zahtevajo drage instrumente in kartuše. Novi pristop CRISPR želi zapolniti to vrzel: terenska diagnostika, ki deluje pri 37 °C, z odčitki s papirnatih trakov in možnostjo shranjevanja reagentov brez hlajenja.

Omejitve in kaj sledi

To je zgodnja demonstracija na majhnem kliničnem naboru – potrebni so obsežni, večcentrični testi (vključno s sočasno okužbo z virusom HIV, pri otrocih, s paucibacilarnimi oblikami in različnimi linijami MBT). Avtorji posebej ugotavljajo, da bo treba v sami "terenski" različici namizno centrifugo zamenjati s popolnoma ročno rešitvijo. Toda sama arhitektura – "dve tarči + notranja kontrola" v eni epruveti – je že dokazala svojo operativnost in zagotavlja jasno pot do izboljšanja za množično uporabo.

Vir: Alexandra G. Bell et al. Poenostavljen test CRISPR za odkrivanje tuberkuloze neposredno iz sputuma, Science Advances, na spletu, 6. avgust 2025 (letnik 11, številka 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206